（一）原理
從供體獲取組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)叫原代細(xì)胞培養(yǎng)或初代細(xì)胞培養(yǎng)(primary culture)。原代細(xì)胞離體時(shí)間短， 具有二倍體遺傳性，在一定程度上能反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性，很適合作藥物測(cè)試、細(xì)胞分化和轉(zhuǎn)化等實(shí)驗(yàn)研究。在臨床應(yīng)用中，短期原代培養(yǎng)細(xì)胞的移植療效明顯高于未經(jīng)培養(yǎng)的組織細(xì)胞。故體外培養(yǎng)的人體各部位細(xì)胞，尤其是上皮細(xì)胞對(duì)于研究各種疾病的發(fā)生、發(fā)展及防治都具有重要意義。根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康模煌膶?shí)驗(yàn)材料，解離或分離細(xì)胞的方法和條件各有不同。一般常用方法有二：一是組織塊培養(yǎng)法，二是單層細(xì)胞培養(yǎng)法。本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶消化法，對(duì)初生乳鼠肺組織進(jìn)行原代培養(yǎng)。
（二）實(shí)驗(yàn)用品
1. 材料：新生乳鼠。
2. 器材：眼科剪、眼科鑷、泡器械（直徑 15cm ）培養(yǎng)皿、動(dòng)物解剖用的泡沫支架、青霉素瓶、吸管、培養(yǎng)瓶、離心管、廢液瓶、倒置顯微鏡、二氧化碳培養(yǎng)箱、電磁攪拌器。
3. 試劑：Hank’s液、RPMI-1640液、血清細(xì)胞培養(yǎng)液、安爾碘、酒精。
（三）無(wú)菌操作基本要領(lǐng)和要求
1.操作準(zhǔn)備：把實(shí)驗(yàn)用品放置于超凈臺(tái)內(nèi)，打開紫外線殺菌燈和超靜臺(tái)風(fēng)機(jī)，30分鐘后關(guān)閉紫外線燈。由于紫外線消毒時(shí)產(chǎn)生臭氧，對(duì)身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。實(shí)驗(yàn)溶液恢復(fù)至室溫后使用，培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等避免紫外線照射。
2.洗手：雙手經(jīng)洗手、泡手、酒精消毒，原則上和外科手術(shù)相同。在利用超凈臺(tái)工作時(shí)，因整個(gè)前臂要伸入超凈臺(tái)內(nèi)，洗刷時(shí)一定要清洗到肘部。
3.火焰消毒：在無(wú)菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無(wú)菌操作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈。以后操作，如安裝吸管帽、啟開或封閉瓶口等，都需經(jīng)過火焰燒灼后在火焰近處進(jìn)行。金屬器械在火焰上燒得時(shí)間不能過長(zhǎng)，以防退火。燒過的金屬都要冷卻后再使用，以免造成組織損傷。已吸取過營(yíng)養(yǎng)液的吸管不能再用火焰燒灼，因吸管頭中殘留營(yíng)養(yǎng)液能燒焦形成炭膜，再用時(shí)會(huì)把有害物帶入培養(yǎng)液中。消毒火焰要求無(wú)色或微藍(lán)色，而紅黃色或發(fā)黑的火苗，表示燃燒不完全或含有雜質(zhì)，有害物能混入培養(yǎng)液內(nèi)。因此酒精燈需用96％的不含雜質(zhì)的酒精，絕不能使用含有二甲苯和甲醇的酒精。
4.培養(yǎng)操作：進(jìn)行培養(yǎng)操作時(shí)，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動(dòng)，增加污染機(jī)會(huì)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒觸及部，如不便消毒時(shí)，應(yīng)取備品更換。為便于拿送用品，工作臺(tái)面上的用品要有合理的布局；原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，酒精燈置于中央。培養(yǎng)液在用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。培養(yǎng)用瓶開口以后，應(yīng)保持45度斜位 或平放，長(zhǎng)時(shí)間開口向上直立可增加落菌機(jī)會(huì)。吸取營(yíng)養(yǎng)液、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使用吸管，不能混用，以防擴(kuò)大污染或?qū)е陆徊嫖廴尽９ぷ髦胁荒苊嫦虿僮饕爸v話或咳嗽，以免唾沫把細(xì)菌或支原體帶入工作臺(tái)面發(fā)生污染。
（四）操作步驟
1. 組織塊法（以乳鼠肺組織原代培養(yǎng)為例）
（1）取材 將1-3天新生乳鼠，尾巴提起，整個(gè)身體浸入75%酒精的燒杯中3秒左右（默數(shù)5下），取置滅菌的培養(yǎng)皿中，移入工作臺(tái)內(nèi)。小鼠仰位固定在泡沫塑料板上，大頭針分別固定鼠頭、尾和四肢。安爾碘消毒胸廓部位皮膚。在胸廓正中線中位處，用兩把眼科彎鑷（第1套器械）夾起皮膚（多夾些），向左右兩側(cè)頭端撕拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，膈肌部位皮膚向尾端拉，皮膚外翻固定，軀干部肌肉暴露（注意！不要使表 皮面接觸到已暴露出來(lái)的胸腹肌）。酒精消毒胸廓后，沿著膈膜剪斷胸廓，并將胸骨兩側(cè)肋骨剪斷（第II套器械）。胸廓暴露后，可見跳動(dòng)心臟和粉紅色肺。將眼科鑷彎頭端向上（第III套器械），從心臟右上方位插入心肺連接處，輕輕向上用力，將心肺一齊取出，用鑷子去除心臟，移入已加Hank's液的青霉素瓶?jī)?nèi)。
（2）漂洗
用Hank’s液漂洗肺臟表面血污，然后粗剪幾下，再用Hank's液漂洗多次后，吸去多余水分。
（3）剪切
組織小塊置青霉素瓶一角（上圖），眼科直剪用力反復(fù)剪切組織塊成 1mm3大小，剪切時(shí)為保持組織濕潤(rùn)，可以向組織塊滴加1-2滴血清培養(yǎng)液。此過程約15-20分鐘。
（4）接種
剪切后加少量培養(yǎng)液至1mm3大小的組織小塊中。用吸管頭將組織小塊移入培養(yǎng)瓶中，小塊均勻擺置，塊間距0.3cm 左 右，加蓋。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶接種面向下， 37℃ 、5%CO2培養(yǎng)。1-4小時(shí)后，組織小塊貼附瓶壁，從瓶側(cè)面加入培養(yǎng)液，再輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使液體慢慢覆蓋組織小塊，靜止培養(yǎng)，逐漸從組織塊周邊生出新細(xì)胞。
2. 消化法（以0.25%胰蛋白酶為例，pH 7.4-8.0為例）
（1）（2）（3）步同組織塊法
（4）消化
用Hank's液將剪刀面組織小塊沖入青霉素瓶?jī)?nèi)，然后將瓶?jī)?nèi)小組織塊用Hank's液移入離心管中，低速離心（500-800轉(zhuǎn)），7分鐘。用吸管去除上清液，加入沉淀量的5-8倍0.25%胰蛋白酶液，混勻后加入磁棒并套好離心管塞。離心管放入電磁攪拌器上的 37℃ 水浴杯內(nèi)。隨消化時(shí)間的增加，組織塊顏色逐漸變白，分離細(xì)胞逐漸增多，消化液混濁，消化合適時(shí)，常見消化液中有一團(tuán)松散的白色絮狀物（這是因?yàn)閯偡蛛x單細(xì)胞的膜表面有粘性，磁力攪拌作用使它們相互松散結(jié)合在一起）或消化液呈白色均勻的渾濁物。此時(shí)要及時(shí)終止消化。取出離心管。
（5）制備消化細(xì)胞懸液
離心管外壁和管口處經(jīng)酒精消毒后進(jìn)入超凈臺(tái)內(nèi)。管口火焰消毒，HanK's液加至10ml。 吸管插入管底,吸管頭反復(fù)輕輕吹打松散組織，使其順利地通過吸管口，分散成單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)狀態(tài)。離心管直立靜置片刻，未消化組織塊自然沉降（可加消化液再消化）。將細(xì)胞懸液移至另一離心管（管內(nèi)先加1ml血清細(xì)胞培養(yǎng)基）中，補(bǔ)加Hank's液至10ml，細(xì)胞混勻后低速離心（速度、時(shí)間同前）。去上清液。
（6）接種 加20%血清細(xì)胞培養(yǎng)液，細(xì)胞混勻計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5.0×105/ml的密度接種到培養(yǎng)瓶，移入 37℃ ，5%CO2溫箱中培 養(yǎng)。
（四）結(jié)果
1.組織塊法培養(yǎng)的細(xì)胞觀察
在倒置顯微鏡下，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)的組織塊邊緣有少量梭形或長(zhǎng)條形細(xì)胞游離出來(lái)，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，組織塊周圍的細(xì)胞數(shù)量越來(lái)越多，呈放射狀向外擴(kuò)展，最邊緣的細(xì)胞能夠通過變形運(yùn)動(dòng)向外延伸，細(xì)胞密度較大時(shí)才連成片，反之，則連接成網(wǎng)狀。這些細(xì)胞的核明顯，呈橢圓形。胞質(zhì)均勻，透明度大，靠近組織塊的細(xì)胞體積較小，離組織塊較遠(yuǎn)的區(qū)域細(xì)胞體積較大。
2.胰蛋白酶消化法培養(yǎng)的細(xì)胞觀察
用倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，剛接種于培養(yǎng)瓶中時(shí)，細(xì)胞是圓形、懸浮的。24h后，多數(shù)細(xì)胞附著于培養(yǎng)瓶底部（貼壁），胞體伸展，常向外伸出2-3個(gè)長(zhǎng)短不同的突起，由于突起數(shù)目不同，細(xì)胞形態(tài)有梭形、扇形或星形。細(xì)胞邊緣不整齊、胞漿透亮。細(xì)胞核呈橢圓形，核仁明顯。
（五）注意事項(xiàng)
1.吸液體前，瓶口和吸管火焰消毒。吸液體時(shí)，聽不到兩者的碰撞聲。
2.離心管入臺(tái)前，做好管口、管壁消毒。
3.實(shí)驗(yàn)者離開超凈臺(tái)時(shí)，要隨即用肘部關(guān)閉工作窗。
4.器械用后用酒精棉球擦去血污，泡入另一個(gè)皿中，器械浸泡時(shí)剪刀口要叉開放，鑷子彎頭要向下放，皿加蓋繼續(xù)消毒。
5.器材使用時(shí)既要注意消毒，又要防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞。
火焰消毒的吸管一定要經(jīng)Hank's液冷卻和濕潤(rùn)管內(nèi)壁（這是因?yàn)閯偡蛛x的組織細(xì)胞易粘在管壁上）。
6.超凈臺(tái)內(nèi)溫度、濕度較大，夏天工作臺(tái)內(nèi)散熱慢，細(xì)胞懸液混勻、接種時(shí)，離火焰要稍遠(yuǎn)些。
7.組織塊剪切時(shí)，用吸管頭將組織塊細(xì)胞推向青霉素瓶一角，然后將有組織塊的瓶面翻向上方，吸去流向?qū)?cè)的多余水分。多余水分若不除去，則組織塊剪切不細(xì)，消化后細(xì)胞懸液清亮（細(xì)胞數(shù)少）并可見消化液中有線性絮狀物漂浮。
服務(wù)內(nèi)容:
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定(鑒定可提供流式細(xì)胞儀檢測(cè)、免疫細(xì)胞化學(xué)、RT-PCR 、蛋白免疫印跡等多種方法檢測(cè))。
服務(wù)特點(diǎn):
● 細(xì)胞傳代代數(shù)低(一般4代)，細(xì)胞狀態(tài)好，無(wú)污染；
● 可以提供多種原代培養(yǎng)的細(xì)胞。
客戶須知:
1、詳細(xì)說(shuō)明進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)的組織，并確定組織是由客戶提供還是本公司提供；
2、盡可能提供該原代細(xì)胞的培養(yǎng)條件，或者由本公司摸索培養(yǎng)條件；
3、對(duì)于一些常見的原代培養(yǎng)組織，因?yàn)楸４孢\(yùn)輸?shù)牟槐憧赡軙?huì)降低原代培養(yǎng)的成功率，建議客戶選擇由本公司提供相應(yīng)的組織。
收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果：
歡迎咨詢?cè)斦劊覀儠?huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。
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